1、高速逆流色譜儀分配系數(shù)測定法

一個穩(wěn)定的兩相溶劑體系是否適合于目標(biāo)物質(zhì)的分離，通常要看物質(zhì)在該溶劑體系中的分配系數(shù)是否在一個合適的范圍內(nèi)。分配系數(shù)K=CS/CM或CU/CL。其中CS指溶質(zhì)在固定相中的濃度，CM指在流動相中的濃度，CU指溶質(zhì)在上相中的濃度，CL指溶質(zhì)在下相中的濃度。一般而言，對HSCCCzui合適的K值范圍是0.5~2。當(dāng)CS/CM≤0.5時，出峰時間太快，峰之間的分離度較差；當(dāng)CS/CM≥1時，出峰時間太長且峰形變寬。而當(dāng)0.5<CS/CM<2時，可以在合適的時間內(nèi)，得到分離度較好的峰形。

溶質(zhì)的分配系數(shù)可以采用分析型HPLC來確定。如果有目標(biāo)成分的對照品或標(biāo)準(zhǔn)品，當(dāng)溶質(zhì)在兩個互混溶的液相中分配之后，各組分的濃度即可用HPLC測定出來，從而計算出分配系數(shù)K值。如果沒有目標(biāo)成分的標(biāo)準(zhǔn)品，混合物中各組分的分配系數(shù)值可以通過下述方法進行簡單的計算：即先將一定量的樣品溶解在體積為Vu的上層溶液中，然后再用體積為VL的下層進行分配，分別測定分配前和分配后上層溶液中各組分的響應(yīng)值，然后用圖1所示的方法即可計算出分配系數(shù)。同樣，也可以采用薄層色譜法來測定各組分的分配系數(shù)。

2、高速逆流色譜儀HPLC掃描法

對于一個未知樣品，可以通過HPLC掃描的方法，對樣品的復(fù)雜程度及其組分的極性程度有一個初步的了解。具體來講，可以將樣品注入一根15cm長的C18HPLC柱，以乙腈和水為流動相，以1ml/min流速，從100%乙腈梯度洗脫1h，觀察樣品出峰的位置。如果絕大部分峰的保留時間都小于15min，也就意味著這些組分是由含量小于25%的乙腈流動相洗脫出來的，在CCC中可以采用極性溶劑體系，如正丁醇-水等；如果峰的保留時間是在15～50min之間，意味著這些物質(zhì)具有中等極性，在CCC中可以采用中等極性溶劑；如果絕大部分峰在50min后洗脫出來，也就是由大于80%的乙腈流動相洗脫出來的，那么在CCC分離中應(yīng)該采用弱極性的容積體系。

3、高速逆流色譜儀薄層色譜法

    采用薄層色譜（TLC）法也可選擇對HSCCC合適的兩相溶劑體系。在硅膠板上作薄層色譜試驗，用水飽和的有機層（即兩相中的有機相）作展開劑。如果需要分離的組分的Rf＞0.5（低級性溶質(zhì)），這說明此種條件適用于這些組分混合物的分離，而且弱極性的有機相適用于作流動相。對于極性較大的溶質(zhì)Rf＜0.5，則極性較強的那一相可作流動相。這種方法只能給出應(yīng)選溶劑體系的大體指示，因為TLC本身就包含有分配和吸附兩種機理，而CCC則是純粹的液-液分配過程。然而，TLC仍不失為一種簡便易行的手段，當(dāng)小量的樣品在溶劑體系的兩相之間分配時，TLC仍能用來檢查其分布狀況。比如，如果發(fā)現(xiàn)樣品幾乎全分布在一相之中，那么這個溶劑體系是不能用的。

4、高速逆流色譜儀生物活性物質(zhì)分配比率法 

這是一種只適合于具有生物活性成分的方法，其原理基于需分離的混合物的生物活性分布規(guī)律。首先振搖溶有樣品的兩相溶劑體系，然后分別測定上層和下層溶液的生物活性。在兩相中活性分布比較均衡的溶劑體系即可采用。這一方法的缺點是要獲得生物測試的結(jié)果往往需要較長的時間。該方法主要用于抗生素的分離。

5、高速逆流色譜儀分析型HSCCC法

用分析型HSCCC法來選擇制備型分離時所用的溶劑體系是一種很實用的方法。由于其柱體積小、所需溶劑量少，在很短的時間內(nèi)即可獲得合適溶劑體系的信息。

    溶劑體系的選擇和優(yōu)化是一項復(fù)雜而艱巨的工作，目前有關(guān)溶劑體系的選擇方法和評價體系較多，但是系統(tǒng)性和理論性較差，實際操作起來較為困難。因此，在實際工作中，溶劑體系的篩選通常更多的是參考已知的溶劑體系，或者根據(jù)經(jīng)驗而進行的。